固相萃取柱（SPE 柱）是實(shí)驗(yàn)室樣品前處理的核心工具，廣泛用于食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域的樣品純化與富集，能有效去除雜質(zhì)、提高后續(xù)檢測(cè)準(zhǔn)確性。很多新手在操作時(shí)容易因步驟不當(dāng)導(dǎo)致回收率低、純度差，本文結(jié)合實(shí)用需求，詳細(xì)拆解固相萃取柱的操作流程、關(guān)鍵要點(diǎn)及問(wèn)題解決方案，幫你快速掌握正確用法。

一、固相萃取柱操作前必做：3 步準(zhǔn)備工作

操作前的準(zhǔn)備直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需重點(diǎn)確認(rèn)耗材、溶劑和工具的適配性，避免后續(xù)失誤：

1. 選對(duì)固相萃取柱：根據(jù)目標(biāo)物性質(zhì)定類(lèi)型

不同機(jī)理的 SPE 柱適用于不同極性、電荷的目標(biāo)物，選錯(cuò)柱子會(huì)直接導(dǎo)致萃取失敗，常見(jiàn)類(lèi)型及適用場(chǎng)景需精準(zhǔn)匹配：

反相柱（如 C18、C8）：通過(guò)疏水作用保留非極性 / 弱極性物質(zhì)（如農(nóng)藥殘留、多環(huán)芳烴），典型用于環(huán)境水樣中有機(jī)污染物富集、食品中獸藥殘留檢測(cè)；

正相柱（如硅膠、Florisil）：通過(guò)極性作用保留極性物質(zhì)（如維生素、酚類(lèi)），典型用于油脂樣品中極性雜質(zhì)去除、農(nóng)產(chǎn)品中除草劑純化；

離子交換柱（如 SCX、SAX）：通過(guò)離子作用保留帶電物質(zhì)（如氨基酸、生物堿、有機(jī)酸），典型用于生物樣本（血清、尿液）中藥物代謝物提取、食品中添加劑分離；

親和柱（如免疫親和柱）：通過(guò)特異性結(jié)合保留特定目標(biāo)物（如黃曲霉毒素、抗生素），典型用于食品中痕量毒素檢測(cè)、醫(yī)藥中雜質(zhì)精準(zhǔn)去除。

同時(shí)需確認(rèn)柱容量（如 100mg/3mL、500mg/6mL），樣品中目標(biāo)物總量需≤柱容量（通常 100mg 填料可吸附 1-10mg 目標(biāo)物），避免過(guò)載導(dǎo)致萃取失效。

2. 配好溶劑：4 類(lèi)溶劑功能不同，純度要達(dá)標(biāo)

溶劑需根據(jù) SPE 柱類(lèi)型選擇，且必須為色譜純或分析純（避免雜質(zhì)干擾檢測(cè)），具體用途需明確區(qū)分：

活化溶劑：核心作用是去除柱內(nèi)雜質(zhì)（如生產(chǎn)殘留的填料碎屑、防腐劑）、活化填料活性位點(diǎn)。反相柱常用 “強(qiáng)溶劑（甲醇）+ 弱溶劑（超純水）” 組合；正相柱常用正己烷、乙酸乙酯；離子交換柱常用含一定離子強(qiáng)度的緩沖液（如 0.1mol/L 鹽酸）；

上樣溶劑：用于溶解或稀釋樣品，極性需與活化后填料一致，避免目標(biāo)物提前洗脫。反相柱上樣溶劑含水量需≥80%；離子交換柱需根據(jù)目標(biāo)物電荷調(diào)節(jié)樣品 pH（如酸性目標(biāo)物調(diào)至 pH=2，增強(qiáng)與陽(yáng)離子填料的結(jié)合力）；

淋洗溶劑：僅洗脫與填料弱結(jié)合的雜質(zhì)，極性介于活化溶劑與洗脫溶劑之間。反相柱常用 5%-10% 甲醇水溶液；正相柱常用 10%-20% 乙酸乙酯 - 正己烷混合液；

洗脫溶劑：需將目標(biāo)物從填料上完全洗脫，極性需滿足 “反相柱用強(qiáng)極性溶劑（如純甲醇、乙腈），正相柱用弱極性溶劑（如甲醇、乙醇）”；離子交換柱常用高濃度鹽溶液（如 1mol/L 氯化鈉）或酸堿溶液。

3. 備齊工具：這些設(shè)備不能少

核心設(shè)備：固相萃取裝置（負(fù)壓 manifold，用于控制溶劑流速）、真空泵（需將負(fù)壓穩(wěn)定在 0.02-0.05MPa，避免壓力過(guò)高或過(guò)低影響萃取）；

輔助工具：移液槍?zhuān)?mL/10mL/50mL 規(guī)格，用于精準(zhǔn)量取溶劑和樣品）、0.22μm/0.45μm 濾膜（過(guò)濾樣品中的懸浮顆?；虺恋?，防止堵塞填料）、離心管（用于樣品預(yù)處理，如離心除雜）、收集管（需匹配后續(xù)分析儀器，如 10mL 離心管、2mL 色譜進(jìn)樣瓶）。

二、固相萃取柱核心操作：2 種機(jī)理，步驟不同（附操作要點(diǎn)）

固相萃取的核心是 “選擇性吸附與解吸”，根據(jù)保留目標(biāo)物或保留雜質(zhì)的不同，操作步驟分為 “四步法” 和 “三步法”，是新手易混淆的部分，需重點(diǎn)區(qū)分并嚴(yán)格執(zhí)行：

（一）機(jī)理 1：填料保留目標(biāo)物（常用，如富集農(nóng)藥殘留）

適用于目標(biāo)物含量低、需富集，或樣品中雜質(zhì)較多需純化的場(chǎng)景（如環(huán)境水樣中農(nóng)藥殘留檢測(cè)、醫(yī)藥樣品中微量成分提?。?，操作分 4 步，每步要點(diǎn)直接影響目標(biāo)物回收率：

1. 活化：關(guān)鍵是 “不讓填料干化”

操作流程：① 用 3-5 倍柱體積（BV，如 3mL 規(guī)格柱子加 9-15mL 溶劑）的強(qiáng)溶劑，以 1-2 滴 / 秒的流速緩慢推過(guò)填料；② 換用 3-5 倍柱體積的弱溶劑，繼續(xù)緩慢沖洗，平衡填料至與上樣溶劑極性一致；

核心目的：去除柱內(nèi)雜質(zhì)，打開(kāi)填料的活性吸附位點(diǎn)，為后續(xù)目標(biāo)物吸附做準(zhǔn)備；

必看注意：活化后必須保持填料層被溶劑覆蓋（液面高于填料 1-2mm），一旦填料干涸出現(xiàn)裂縫，吸附能力會(huì)驟降，需重新活化。

2. 上樣：流速不能快，避免 “穿透”

操作流程：① 將預(yù)處理后的樣品（已過(guò)濾除雜、調(diào)節(jié) pH）用移液槍緩慢加入柱中；② 若樣品體積較大（如 100mL 水樣），可打開(kāi)真空泵，通過(guò)負(fù)壓控制流速≤5mL/min；

核心目的：讓目標(biāo)物與填料充分接觸，被填料選擇性吸附在表面；

必看注意：① 流速不可過(guò)快（＞5mL/min 會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物 “來(lái)不及吸附”，直接隨樣品流出，即 “穿透”，大幅降低回收率）；② 若樣品渾濁或含沉淀，必須先過(guò) 0.45μm 濾膜，否則會(huì)堵塞填料孔隙，導(dǎo)致后續(xù)流速極慢甚至無(wú)法推進(jìn)。

3. 淋洗：只除雜質(zhì)，不丟目標(biāo)物

操作流程：① 加入 3-5 倍柱體積的淋洗溶劑，以 1-2 滴 / 秒的流速緩慢沖洗；② 淋洗結(jié)束后，打開(kāi)真空泵抽 10-15 秒，抽干柱內(nèi)殘留的淋洗液；

核心目的：洗脫與填料弱結(jié)合的雜質(zhì)（如食品樣品中的色素、生物樣品中的蛋白質(zhì)），同時(shí)保留目標(biāo)物；

必看注意：淋洗溶劑強(qiáng)度需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定（可先測(cè)試 3%、5%、10% 甲醇水溶液等梯度濃度），強(qiáng)度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物被一同洗脫，強(qiáng)度過(guò)低則無(wú)法有效去除雜質(zhì)；抽干時(shí)不可過(guò)度，避免填料干涸。

4. 洗脫：確保目標(biāo)物 “全出來(lái)”

操作流程：① 加入 1-3 倍柱體積的洗脫溶劑，讓溶劑充分浸潤(rùn)填料，可浸泡 1-2 分鐘（增強(qiáng)目標(biāo)物與填料的解吸效果）；② 以 1-2 滴 / 秒的流速緩慢推過(guò)填料，用干凈的收集管收集洗脫液；③ 為提高回收率，可重復(fù)洗脫 1 次（換用新的洗脫溶劑），合并兩次收集的洗脫液；

核心目的：將吸附在填料上的目標(biāo)物完全洗脫，用于后續(xù)檢測(cè)（如 HPLC、GC）；

必看注意：洗脫溶劑體積需控制在 1-5mL，避免體積過(guò)大導(dǎo)致后續(xù)濃縮（如氮吹）耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)；若目標(biāo)物易揮發(fā)或氧化，收集后需立即濃縮或加入穩(wěn)定劑（如加 0.1% 甲酸防止降解）。

（二）機(jī)理 2：填料保留雜質(zhì)（如去除食品色素）

適用于目標(biāo)物含量高、雜質(zhì)少，需快速收集目標(biāo)物的場(chǎng)景（如食品中果糖、葡萄糖的純化，農(nóng)產(chǎn)品中水溶性維生素的提?。僮鲀H 3 步，核心是 “及時(shí)收集目標(biāo)物流出液”：

1. 活化：與 “保留目標(biāo)物” 機(jī)理一致

用對(duì)應(yīng)溶劑預(yù)處理填料（如正相柱用乙酸乙酯活化），平衡柱體極性，全程確保填料不干涸，避免影響雜質(zhì)吸附效果。

2. 上樣：從加樣品開(kāi)始，就收集流出液

操作流程：將樣品溶液緩慢加入柱中，從樣品第一次接觸填料開(kāi)始，立即將收集管接在柱出口，以 1-2 滴 / 秒的流速控制樣品流出，此時(shí)目標(biāo)物隨溶液穿出柱子，雜質(zhì)被填料吸附；

核心目的：快速分離目標(biāo)物與雜質(zhì)，避免目標(biāo)物在柱內(nèi)滯留導(dǎo)致?lián)p失；

必看注意：不可等樣品全上完再收集，否則部分目標(biāo)物會(huì)被填料短暫吸附，導(dǎo)致回收率降低。

3. 洗脫（收集）：確保目標(biāo)物 “全洗出”

操作流程：上樣結(jié)束后，繼續(xù)用 3-5 倍柱體積的淋洗溶劑（與上樣溶劑極性一致，如純水）沖洗柱子，收集所有流出液（包括上樣時(shí)的流出液），合并后用于后續(xù)分析；

核心目的：將柱內(nèi)殘留的目標(biāo)物完全沖出，避免因目標(biāo)物滯留導(dǎo)致的損失。

三、新手必知：5 個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題 + 解決方案（附回收率低原因）

很多人操作后會(huì)遇到 “回收率低”“純度差”“柱子堵塞” 等問(wèn)題，其實(shí)多是細(xì)節(jié)把控不當(dāng)導(dǎo)致，對(duì)應(yīng)解決方案如下：

1. 回收率低（＜70%）

核心原因：① 填料活化后干涸，活性位點(diǎn)失效；② 上樣流速過(guò)快，目標(biāo)物未吸附就 “穿透”；③ 洗脫溶劑強(qiáng)度不足，目標(biāo)物未完全解吸；④ 柱容量過(guò)載，目標(biāo)物無(wú)法被完全吸附；

解決方案：① 活化后始終保持液面覆蓋填料，若干涸需重新活化；② 降低上樣流速至≤5mL/min，或采用重力上樣（不用負(fù)壓）；③ 提高洗脫溶劑強(qiáng)度（如反相柱可改用甲醇 + 乙腈混合液），或增加洗脫體積、延長(zhǎng)浸泡時(shí)間；④ 減少樣品上樣量，或更換更大容量的 SPE 柱（如從 100mg/3mL 換為 500mg/6mL）。

2. 洗脫液純度差（雜質(zhì)多）

核心原因：① 淋洗溶劑強(qiáng)度不夠，與填料弱結(jié)合的雜質(zhì)未被洗脫；② 樣品預(yù)處理不充分，含大量色素、懸浮顆粒等干擾物；

解決方案：① 適當(dāng)提高淋洗溶劑強(qiáng)度（如反相柱可將甲醇濃度從 5% 提升至 10%），或增加淋洗體積；② 上樣前用 0.22μm 濾膜過(guò)濾樣品，或先通過(guò)液液萃取（如用乙酸乙酯萃?。╊A(yù)處理，提前去除部分雜質(zhì)。

3. 柱子堵塞，流速極慢

核心原因：① 樣品中含大量懸浮顆粒或沉淀，堵塞填料孔隙；② 真空泵負(fù)壓過(guò)大，導(dǎo)致填料被壓實(shí)；

解決方案：① 樣品先離心（5000rpm，5 分鐘）取上清液，或用 0.45μm 濾膜過(guò)濾后再上樣；② 將真空泵負(fù)壓降至 0.02-0.03MPa，避免填料壓實(shí)（壓實(shí)后不可逆，需更換新柱）。

4. 平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大

核心原因：① 各次操作中溶劑流速不一致；② 溶劑體積添加錯(cuò)誤（如活化僅用 2 倍柱體積，未達(dá) 3-5 倍要求）；③ 淋洗、洗脫階段的浸泡時(shí)間不統(tǒng)一；

解決方案：① 用固相萃取裝置的負(fù)壓閥精準(zhǔn)控速，或用移液槍勻速推注溶劑；② 嚴(yán)格按 “3-5 倍柱體積” 用量，用刻度管或移液槍精準(zhǔn)量取溶劑；③ 統(tǒng)一浸泡時(shí)間（如固定為 1 分鐘），避免隨意調(diào)整。

5. 目標(biāo)物降解（檢測(cè)不到目標(biāo)峰）

核心原因：① 樣品 pH 不適宜，導(dǎo)致目標(biāo)物在萃取過(guò)程中降解（如酸性目標(biāo)物在堿性環(huán)境中分解）；② 洗脫后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，目標(biāo)物被氧化或揮發(fā)；

解決方案：① 上樣前根據(jù)目標(biāo)物性質(zhì)調(diào)節(jié)樣品 pH（如酸性目標(biāo)物調(diào)至 pH=2-3，堿性目標(biāo)物調(diào)至 pH=8-9）；② 洗脫后立即進(jìn)行濃縮、定容，或加入穩(wěn)定劑（如易氧化物質(zhì)可加維生素 C，易揮發(fā)物質(zhì)需密封低溫保存），并盡快進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

四、固相萃取柱應(yīng)用場(chǎng)景：這些領(lǐng)域都在用

掌握正確操作后，固相萃取柱可廣泛應(yīng)用于多領(lǐng)域樣品前處理，常見(jiàn)場(chǎng)景如下：

食品檢測(cè)：去除蜂蜜中的色素、蛋白質(zhì)雜質(zhì)，富集雞肉、魚(yú)肉中的獸藥殘留，如氟喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)等；

環(huán)境監(jiān)測(cè)：富集河流、湖泊水樣中的多氯聯(lián)苯、有機(jī)磷農(nóng)藥，用螯合型 SPE 柱提取土壤中的重金屬（如鉛、鎘、汞）；

醫(yī)藥領(lǐng)域：從血清、尿液中提取抗生素、抗腫瘤藥物的代謝物，純化中藥提取物，如從黃芪中提取黃芪甲苷，去除多糖、鞣質(zhì)等雜質(zhì)；

農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)：去除蔬菜（如菠菜、生菜）中的葉綠素干擾，富集水果（如蘋(píng)果、葡萄）中的展青霉素、多菌靈等真菌毒素和農(nóng)藥殘留。